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모듈식 및 조정 가능한 단백질 바이오센서의 새로운 설계

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모듈식 및 조정 가능한 단백질 바이오센서의 새로운 설계

자연 591권, 페이지

Nature 591권, 482~487페이지(2021)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

자연적으로 발생하는 단백질 스위치는 세포 및 임상 응용을 위한 바이오센서 및 리포터 개발을 위해 용도가 변경되었습니다1. 그러나 이러한 스위치의 수는 제한되어 있으며 리엔지니어링이 어렵습니다. 여기에서 우리는 펩타이드 키의 결합이 관심 있는 생물학적 출력을 유발하는 새롭게 설계된 단백질 스위치를 통해 정보의 흐름을 반전시킴으로써 일반적인 종류의 단백질 기반 바이오센서가 생성될 수 있음을 보여줍니다2. 설계된 센서는 닫힌 암흑 상태와 개방형 발광 상태를 갖는 모듈형 분자 장치입니다. 분석물 결합은 스위치를 닫힌 상태에서 열린 상태로 구동합니다. 센서는 센서 활성화에 대한 분석물질 결합의 열역학적 결합을 기반으로 하기 때문에 하나의 표적 결합 도메인만 필요하므로 센서 설계를 단순화하고 솔루션에서 직접 판독이 가능합니다. 세포사멸 방지 단백질 BCL-2, IgG1 Fc 도메인, HER2 수용체, 보툴리눔 신경독소 B를 민감하게 검출할 수 있는 바이오센서와 고감도의 심장 트로포닌 I 및 항B형 간염 바이러스 항체에 대한 바이오센서를 만듭니다. 이러한 분자를 임상적으로 검출하는 데 필요합니다. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)3를 추적하기 위한 진단 도구의 필요성을 고려하여 우리는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질용 센서와 막 및 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체를 설계하는 접근 방식을 사용했습니다. 새롭게 설계된 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD) 바인더4를 통합한 전자는 검출 한계가 15pM이고 발광 신호가 배경 수준보다 50배 더 ​​높습니다. 플랫폼의 모듈성과 민감도는 광범위한 분석물질에 대한 센서를 신속하게 구성할 수 있어야 하며, 새롭고 유용한 기능을 갖춘 다중 상태 단백질 시스템을 생성하기 위한 새로운 단백질 설계의 힘을 강조합니다.

단백질 기반 바이오센서는 합성 생물학 및 임상 응용에서 중요한 역할을 하지만 지금까지 바이오센서의 설계는 대부분 천연 단백질을 리엔지니어링하는 데 국한되어 왔습니다1. 결합 시 형태 변화를 겪는 특정 분석물질 결합 도메인을 찾는 것은 어려운 일이며, 가능한 경우에도 이를 리포터 도메인에 효과적으로 연결하려면 일반적으로 광범위한 단백질 공학 노력이 필요합니다5,6. 따라서 관심 있는 다양한 단백질 표적을 검출하기 위해 쉽게 용도를 변경할 수 있는 모듈형 바이오센서 플랫폼을 구축하는 것이 바람직합니다. 항체7,8,9 및 소분자10,11를 검출하기 위해 모듈형 시스템이 개발되었지만, 단백질 구조, 크기 및 올리고머화 상태의 다양성과 반합성 단백질 플랫폼12,13,14과 같은 접근법을 고려할 때 일반 단백질 센서는 더 큰 과제입니다. 또는 칼모듈린 스위치15,16는 일반적으로 예측 가능성이 제한되어 잠재적 후보를 찾기 위해 상당한 검사가 필요합니다.

단백질 바이오센서는 두 개의 거의 등에너지 상태를 갖는 시스템으로 구성될 수 있으며, 그 사이의 평형은 감지되는 분석물에 의해 조절됩니다. 이러한 센서의 바람직한 특성은 다음과 같습니다. (i) 분석 물질에 의해 유발된 형태 변화는 분석 물질의 세부 사항과 독립적이어야 하므로 동일한 전체 시스템을 사용하여 다양한 대상을 감지할 수 있습니다. (ii) 시스템은 다양한 결합 에너지와 다양한 일반 농도를 갖는 분석물을 넓은 동적 범위에서 검출할 수 있도록 조정 가능해야 합니다. (iii) 형태 변화는 민감한 결과와 결합되어야 합니다. 우리는 관심 대상 단백질에 대한 결합이 펩타이드 액추에이터의 존재에 의해 제어되는 de novo 설계 단백질 스위치에서 정보 흐름을 반전시킴으로써 이러한 특성을 얻을 수 있다는 가설을 세웠습니다. 우리는 두 가지 단백질 구성 요소로 구성된 시스템을 개발했습니다. 첫째, 케이지 도메인과 표적 결합 모티프 및 분할 루시퍼라제 단편(소형 BiT(SmBiT) 114)을 포함하는 래치 도메인으로 구성된 'lucCage'입니다. 둘째, lucCage의 개방 상태에 결합하는 주요 펩타이드와 상보적 분할 루시퍼라제 단편(대형 BiT(LgBit) 11S)18을 포함하는 'lucKey'입니다(그림 1a). lucCage에는 두 가지 상태가 있습니다. 케이지 도메인이 래치에 결합하고 표적과 SmBiT가 LgBit과 결합하여 루시퍼라제 활성을 재구성하는 바인딩 모티프를 입체적으로 차단하는 닫힌 상태와 이러한 결합 상호 작용이 다음과 같은 열린 상태입니다. 차단되지 않았으며 lucKey는 케이지 도메인에 바인딩할 수 있습니다. lucKey와 lucCage의 결합으로 인해 루시퍼라제 활성이 재구성됩니다(그림 1a, 오른쪽). 시스템의 열역학은 lucCage에 대한 lucKey의 결합 자유 에너지(ΔGCK)가 목표가 없는 경우(ΔGopen - ΔGCK >> 0) lucCage 개방의 자유 에너지 비용(ΔGopen)을 극복하기에 불충분하도록 조정됩니다. 표적의 존재, 표적에 대한 래치의 추가 결합 자유 에너지(ΔGLT)는 래치 개방 및 루시퍼라제 재구성을 유도합니다(ΔGopen - ΔGCK - ΔGLT << 0)(그림 1b, c). 이 시스템은 광범위한 결합 활동을 가두어 둘 수 있고 스위치가 열역학적으로 제어되므로 lucKey 및 표적 결합 에너지를 조정하여 관련 표적 농도에서 활성화를 달성할 수 있으므로 위의 특성 (i) 및 (ii)를 충족합니다. lucKey와 lucCage는 항상 동일하기 때문에 시스템은 모듈식입니다. 즉, 동일한 분자 연관성이 다양한 표적의 결합에 결합될 수 있습니다. 생물발광은 분석물 기반 lucCage-lucKey 연관성에 대한 빠르고 민감한 판독을 제공하여 속성(iii)을 만족시킵니다.

15 ng ml−1; within the detection range of lucCageHER2) associated with metastatic breast cancer26./p>18 years) of both genders provided by the Director of the Clinical Chemistry Division, the hospital of University Washington. All anonymized donor specimens were provided de-identified. Because the donors consented to have their excess specimens be used for other experimental studies, they could be transferred to our study without additional consent. All samples were passed through 0.22-μm filters before use. Ten microlitres of 10× serial diluted monomeric RBD (167–0.69 nM), 5 μl of 20× lucCage (20 nM), 5 μl of 20× lucKey (20 nM), 5 μl of 20× Antares2 (2 nM), and 10, 20, 25 or 50 μl of human donor serum or simulated nasal matrix were mixed with 1:1 HBS:Nano-Glo assay buffer to reach a total volume of 75 μl. The plate was centrifuged at 1,000g for 1 min. Then, 25 μl of 25× diluted furimazine in buffer was added to each well. Bioluminescence signals were recorded from both 470/40 nm and 590/35 nm channels every 1 min for a total of 1 h. The ratio at each time point was calculated by the equation described in Extended Data Fig. 11b. Monomeric SARS-CoV-2 RBD was expressed and purified as previously described46./p>> I590). R470 is R590 × f, a predetermined constant for Antares2, and therefore the unmixed ratio (I470/R590) could be calculated in real time during signal acquisition. The constant f for Antares2 was consistently determined to be 0.43 by either recording the full spectra or from the filter set. c, Varying concentrations of RBD were spiked in 50%, 25% or 10% pooled serum or in 20% simulated nasal fluid. Absolute bioluminescence intensities and emission kinetics were different across the matrices owing to matrix inhibition effect and substrate turnover53. By contrast, calibration with Antares2 resulted in stable ratiometric signals (I470/R590). d, The bioluminescence intensity of lucCageRBD at saturating RBD concentration (green curve) is approximately 20-fold higher than the background level. Reporting the raw ratio (T470/T590) as a function of the RBD concentration compromises the sensor dynamic range (black curve) owing to a notable emission at the 470/40 nm channel (R470) from Antares2. After calculation and conversion of the unmixed ratio, the dynamic range becomes 20-fold higher than the background level with ratiometric readouts (magenta curve). e, Detection of spiked RBD in four different anonymized human sera (50%) shows that calibration using spectrally resolved Antares2 as an internal reference can minimize the variations of the intensiometric bioluminescence in these matrices. Bioluminescent signals and s.d. were measured in triplicate, and a representative one is shown for emission spectra and emission kinetics, respectively. Data are mean ± s.d./p>